الایزا

 روشها و تکنیک ها

• عوامل ایجاد کننده خطا و مشکلات احتمالی

ELIZA : Enzyme-Linked Immunesorbent Assay

الایزا  يك روش آزمايشگاهي بيوشيميايي ساده با حساسيت بسيار بالا است كه امكان آناليز تعداد زيادي نمونه را به صورت همزمان فراهم مي كند و روشی براي پي بردن به اختلالات سيستم ايمني است تا حضور آنتي‌ژن یا آنتی بادی در یک نمونه را بررسی نماید این تکنیک در پزشکی و پاتولوژی گیاهان و در کنترل کیفی صنایع خصوصا صنایع غذایی کاربرد دارد در یک تعریف ساده ELISA مقدار آنتی ژن فیکس شده در سطح یک ظرف یا پلیت است که سپس با یک آنتی بادی خاص که روی سطح ریخته می شود به آنتی ژن متصل می شود . این آنتی بادی متصل به یک آنزیم است و در مرحله نهایی ، ماده ای به ظرف اضافه می شود که آنزیم بتواند برخی سیگنال های قابل تشخیص را مثل تغییر رنگ با یک ماده شیمیایی ایجاد نماید.

همچنين آنتي بادي‌هايي كه در پاسخ به برخي عفونت‌ها يا بيماري‌ها به‌وجود آمده نيز توسط اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربال‌زني HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقيق شده و به صفحه اي كه حاوي آنتي‌ژن HIV است اضافه مي‌شود. اگر آنتي بادي HIV در سرم وجود داشته باشد، به اين آنتي‌ژن هاي HIV مي چسبد. سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده مي شود. يك “آنتي بادي ثانويه” ساخته شده مخصوص (يك آنتي بادي چسبيده به آنتي بادي ديگري) به پليت اعمال شده و شستشوي ديگري انجام مي‌شود. اين آنتي بادي ثانويه به صورت شيميايي به آنزيم از پيش تهيه شده مي‌چسبد. اين‌بار زير لايه اي براي آنزيم اعمال شده و توسط آنزيم كاتاليز مي‌شود كه منجر به تغيير رنگ در فلورسانس مي شود.

با استفاده از روش ELISA چه چیزی تست می شود ؟

استفاده از روش ساندویچ انتخاب خوبی است برای یک پروتئین که با اپی توپ های متعدد شناسایی شده است،. این حالت معمولا نیاز به دو آنتی بادی دارد که با اپی توپ های مختلف واکنش نشان می دهند. با این حال، اگر مولکول دارای چندین اپی توپ تکراری باشد ممکن است با استفاده از روش ساندویچ از آنتی بادی یکسان برای هر دو جذب و تشخیص استفاده شود.

روش دیگر، اگر یک منبع آنالیت دیگر برای شناسایی به شکل استخراج شده وجود داشته باشد که توانایی جذب در یک microwell را دارد، پس از آن با استفاده از روش های رقابتی می تواند روشی را راه اندازی نماید که که در آن آنالیت استخراج شده بی حرکت و آنالیت در نمونه برای اتصال به آنتی بادی برچسب دار شده رقابت ایجاد نماید.

تست الايزا را در حالت معمول براي رديابي آنتي ژن يا آنتي بادي بكار مي برند بدين ترتيب كه يكي از اين دو ماده در بستر جامد ثابت مي شود و براي رديابي دومي بكار گرفته مي شود، اما اساسا براي رديابي هر جفت ماده اي كه مثل جفت آنتي ژن و آنتي بادي به هم گرايش داشته و قدرت اتصال مناسبي نسبت به هم دارند ميتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتين به ليگاند مربوطه اش يا مولكول به گيرنده اختصاصي اش) البته اين پديده يعني اتصال بين دو ماده اي كه آنتي بادي و آنتي ژن نيستند اما گرايش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرين است و براي بالا بردن حساسيت و اختصاصيت اتصال بين آنتي بادي و آنتي ژن در الايزا بايد اين اتصالات ناخواسته را به طريقي مهار كرده و يا كارهاي جبراني لازم را در نظر گرفت.

 الايزا تركيبي از آنتي بادي هاي اختصاصي با حساسيت بالاست بوسيله آنتي بادي ها يا آنتي ژن ها جفت شده به راحتي تشخيص داده می شوند . الايزا مي تواند با سنجش مفيد، غلظت آنتي ژن يا آنتي بادي را انجام دهد 2 روش متفاوت وجود دارد

تست ELISA با روش‌هاي گوناگوني انجام مي‌شود كه كه به صورت كلي به دو دسته ELISA مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندي مي‌شود.: الايزايي كه براي تشخيص حضور آنتي ژن ها مي تواند به كار رود كه بوسيله آنتي بادي شناسايي را انجام مي دهد يا آن مي تواند آزمايش كند آنتي بادي هايي كه آنتي ژن ها را شناسايي مي كنند در الايزاي عمومي 5 مرحله وجود دارد :

1- ديواره پليت ها با آنتي ژن ها كد شده است

2- مسدود كردن تمام نواحي باند نشده براي جلوگيري از جواب هاي مثبت منفي

3- اضافه كردن آنتي بادي اوليه (براي مثال آنتي بادي مونوكلونال خرگوشي ) به چاهك ها

4- اضافه كردن آنتي بادي ثانويه جفت شده با آنزيم (مثل anti IgG موشي ) به چاهك ها

5- واكنش سوبسترا با آنزيم و توليد رنگ بنابراين مشخص شدن واكنش هاي مثبت

مراحل انجام يك آزمون ELISA كه تقريبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از:

1) پوشش دهي، كه به معني جذب يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي با سطوح جامد است.

2) اضافه كردن نمونه‌هاي مورد آزمايش.

3) گذشت مدت زمان كافي براي انجام واكنش كه به اصطلاح انكوباسيون واكنشگرها ناميده مي شود.

4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده ‌.

5) اضافه عوامل لينك شده با آنزيم.

6) مجددا طي مدت زمان انكوباسيون براي واكنشگرها ‌.

7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو ‌.

8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده‌ها.

 9) طي زمان انكوباسيون.

10) اتمام واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده‌ها و خوانش دانسيته نوري به دست آمده توسط خواننده

 مراحل ELISA

• فاز جامد میکرو پلیت هایی هستند که به طور تجاری در دسترس می باشند 8*12 خانه دارند

• مرحله جذب سطحی : در این پروسه آنتی بادی یا آنتی ژن که بصورت محلول در یک بافر قرار دارد اضافه می شود سپس به طور تهاجمی به فاز جامد در حالت انکوبه حمله می کند در واقع عدم حرکت آنتی بادی یا آنتی ژن در فاز ثابت عامل اصلی موفقیت واکنش در ELISA است.

• مرحله شستشو : چاهک ها پر از محلول های بافری می شوند و خالی می شوند برای جدا شدن اتصالات و غیر اتصالات یا آنتی بادی ها یا آنتی ژن های آزاد در پلیت های الایزا ، این مرحله نقش مهمی را در واکنش ها بازی می کند.

• آنتی ژن ها : یک پروتئین یا کربوهیدرات است که وقتی به حیوانات تزریق می شود تولید آنتی بادی می کند بنابراین آنتی بادی ها به طور اختصاصی با آنتی ژن ها واکنش می دهند و می توان از آنها برای تشخیص آنتی ژن ها استفاده نمود

• آنتی بادی : تولیداتی که در پاسخ به آنتی ژن ها ایجاد می شوند از جنس پروتیئن هستند

• آنزیم : ماده ای که می تواند با یک غلظت پایین واکنش دهد مثل کاتالیز کردن واکنش های اختصاصی .چندین آنزیم اختصاصی به طور روتین در الایزا بکار می روند

• آنزیم های کانجوگیت : آنزیم هایی که به طور تغییر ناپذیری به واکنش های مخصوصی حمله می کنند این واکنش ها سیگنالهایی مثل تغییر رنگ که قابل خوانش است ایجاد می کنند ( به طور مستقیم مثل تغییر رنگ ماده یا غیر مستقیم بوسیله تاثیر روی یک ماده شیمیایی دیگر )

• توقف : پروسه توقف فعالیت آنزیم روی یک ماده .این مرحله تاثیر روی توقف تغییرات رنگی بعدی در ELISA دارد

• خوانش: اندازه گیری رنگ تولید شده در ELISA . این کمیت بوسیله خوانش اختصاصی در اسپکتوفتومتری در ولتاژ مخصوص برای رنگ های خاص بدست آمده با آنزیم های خاص انجام می شود این تست ها می تواند بوسیله چشم تشخیص داده شود

چه نوع از روش های ELISA ممکن است به کار رود ؟

الایزای مستقیم: در این الایزا آنتی ژن ها به فاز جامد متصل شده اند و آنزیم ها به آنتی بادی لیبل شده اند این نوع از روش ها به طور کلی در اندازه گیری نمونه های سخت دشوار است، از آنجا که پروتئین های آلوده برای نواحی های اتصال پلاستیکی با هم رقابت دارند

الایزای غیر مستقیم : در این الایزا آنتی ژن ها به فاز جامد متصل شده اند اما در این مورد آنتی بادی اولیه لیبل ندارد وآنزیم کونجوگیتو بعنوان آنتی بادی ثانویه به طور مستقیم به آنتی بادی اولیه وصل می شوند این شکل اغلب به کار می رود. اين روش برای تعيين آنتی بادی اختصاصی و يا تيتراسيون آنتی بادی در نمونه های سرم مورد استفاده قرار می گيرد . اساس آزمايش بدين نحو است که معمولاً سرم رقيق شده به آنتی ژن های کوت شده در فاز جامد ( ميکروول يا چاهک ) اضافه می شود . آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه رد يابی شود ، پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسيون و يک مرحله شستشو آنتی هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهک اضافه می شود بر حسب اينکه چه کلاسی از آنتی بادی برای رديابی اهميت دارد نوع آنتی هيومن مورد استفاده نيز متفاوت است مثلاً برای رديابی آنتی بادی کلاس IgG از آنتی هيومن IgG و برای رديابی کلاس IgA از آنتی هيومن IgA استفاده می شود . بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتی بادی بر عليه توکسوپلاسما ، روبلا ، ويروس سيتومگال و هليکوباکتر پيلوری از کلاس IgM ، IgA و IgG در سرم می باشد .

الایزای رقابتی : این سومین نوع الایزا از روش رقابتی استفاده می کند در این روش به طور همزمان آنتی بادی ها یا پروتئین ها رقابتی اضافه می شود . کاهش در سیگنال نمونه ها جایی که آنتی بادی یا پروتئین دوم نتایج اختصاصی بالایی می دهد روش هاي رقابتي نيز بر پايه رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند.

ساندویچ الایزا : آخرین نوع روشی است که به کار می رود اتصال آنتی بادی ها به فاز جامد حمایت می شود نمونه ها حاوی آنتی ژن های شناخته شده یا ناشناخته هستند سپس بافر یا ماتریکسی اضافه می شود که اتصالات را به فاز جامد به حداقل رسانده اند آنزیم های لیبل شده به آنتی بادی ها سپس برای تشخیص اضافه می شوند . روش ساندويچ كه متداول‌ترين روش ELISA است، يك آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد.

• كد كردن پليت هاي الايزا با آنتي بادي و انكوبه كردن يك شب در 4 Ċ

• شستشوي چاهك پليت با آب دوبار تقطير و PBS و تريتون براي 2 بار

• مسدود كردن باند هاي غير اختصاصي با استفاده از 1% BSA/PBS و انكوبه براي 30-60 دقيقه در دماي اتاق

• شتشوي پليت ،‌اضافه كردن استانداردها و 100ul نمونه محلول متناسب با چاهك ها

• انكوبه 1 ساعت در دماي اتاق و شستشو

• اضافه كردن 100ul آنتي بادي ثانويه جفت شده با آلكالين فسفاتاز (AP ) يا HPR و انكوبه براي 1 ساعت و شستشو

• اضافه كردن 100ul سوبسترا به چاهك و انكوبه در دماي اتاق براي 1 ساعت ( افزودن محلول متوقف كننده )

• خوانش پليت ها روي الايزا ميكروپليت ريدر

بهترین نتیجه از روش ساندویچ بدست می آید روش ساندويچ الايزا خود به دو دسته تقسيم می شود :

الف ) روش Ag Capture يا Ab sandwich :

  در اين روش يک آنتی ژن در بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد ، اين روش شايع ترين روش الايزا محسوب می شود ، در اين روش از يک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن بر روی چاهک های الايزا استفاده می شود و آنتی بادی دوم که با آنزيم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می کند . قابل ذکر است که در اين روش آنتی ژن بايد دارای دو ناحِيه آنتی ژنيک

متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر دو آنتی بادی باشد ، مثال های بارز اين روش اندازه گيری ،TSH ، LH ،FSH ، PSA ، HCG و …

ب ) روش Antibody Capture :

• ·Ag Sandwich or Direct Ab Capture :

اين روش برای تعيين سنجش آنتی بادی مورد استفاده قرار می گيرد بدين صورت که از يک آنتی ژن کوت شده بر روی فاز جامد به دام انداختن آنتی بادی اختصاصی آن استفاده می شود و همان آنتی بادی از طريق بازوی ديگر خود ( Fab ) پذيرای همان آنتی ژن اما به صورت نشاندار می باشد ، در نتيجه آنتی بادی اختصاصی در بين دو آنتی ژن ساندويچ می گردد . در اين روش تعيين آنتی بادی توتال از هر کلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يکی از اختصاصی ترين و حساس ترين روش ها برای تشخيص آنتی بادی در نمونه است . مثال بارز اين روش کيت اندازه گيری آنتی بادی بر عليه پلاسموديوم ويواکس و ترپونما پاليدومو HBsAb می باشد.

4 – الايزای رقابتی يا مهاری

رویداد مرکزی ELISA رقابتی یک فرایند اتصال رقابتی است که توسط آنتی ژن اصلی (آنتی ژن نمونه) و آنتی ژن افزودنی انجام می شود . روش ELISA رقابتی در برخی موارد در مقایسه با ELISA غیر مستقیم، ELISA ساندویچ و ELISA مستقیم متفاوت است.روش به شرح زیر است:

1- آنتی بادی اولیه فاقد لیبل با آنتی ژن نمونه انکوبه می شود

  2- کمپلکس آنتی بادی و آنتی ژن به پلیت 96 خانه اضافه می شوند که از قبل با آنتی ژن مشابه کدگذاری شده است

3- آنتی بادی های غیر متصل شده بوسیله شستشو پلیت حذف می شوند

4- آنتی بادی ثانویه که اختصاصی برای آنتی بادی اولیه است و با یک آنزیم همراه است اضافه می شود

5- سوبسترا اضافه شده و آنزیم باعث ایجاد یک سیگنال رنگی یا فلورسنتی می شود

مزایا :

• مزیت اصلی الایزای رقابتی شامل آنزیم های متصل شده به آنتی بادی است

• اختصاصیت بالا ، از اینرو 2 آنتی بادی استفاده می شود

• مناسب برای نمونه های کمپلکس ، از اینرو نیاز نیست آنتی ژن ها در ابتدا استخراج شوند و اندازه گیری شوند

• انعطاف و حساسیت

در روش های رقابتی اساس سنجش بر رقابت دو آنتی ژن يا دو آنتی بادی ( که يکی از آن دو نشاندار است ) برای اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است اگر هردو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يک دوره انکوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری يا بلاکينگ می نامند . در روش مهاری ممکن است در بين دو مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدی شستشو انجام شود يا انجام نشود ، مثال بارز روش های رقابتی و مهاری سنجش T4 و T3 می باشد .انواع روش هاای رقابتی عبارتند از :

الف ) روش سنجش رقابتی يا مهاری برای آنتی ژن :

اساس اين روش بر رقابت بين آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی بادی اختصاصی کد شده در چاهک استوار است . در اين روش مقدار آنتی بادی کد شده بايد محدود باشد و ملکول سيگنال دهنده همان آنتی ژن نشاندار است ، اساس روش RIA و EIA کلاسيک همين روش است .

در اين روش منحنی پاسخ دوز به صورت معکوس خواهد بود ، بدين معنی که آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادی از آناليت غير نشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود و در نتيجه سيگنال کمتری هم وجود خواهد آمد .

 در برخی از موارد نشاندار کردن روی خصوصيات هاپتن اثر می گذارد در نتيجه در روش رقابتی برای تعيين آنتی ژن از يک آنتی بادی نشاندار استفاده می شود ، در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروری است که فاز جامد توسط آنتی ژن با مقدار کم و ثابت پوشيده می شود ، در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت کد شده در چاهک برای اتصال به آنتی بادی نشاندار رقابت

می کند . در اينجا هم منحنی استاندارد معکوس است ، از اين روش بيشتر برای سنجش ايمنی به روش کمی لومينسانس استفاده می شود .

ب ) روش رقابتی برای آنتی بادی :

در اين روش رقابت بين دو آنتی بادی يکی در نمونه به صورت غير نشاندار و يکی به صورت نشاندار شده با آنزيم برای اتصال به يک آنتی ژن کد شده در چاهک صورت می پذيرد ، بديهی است که هر چه مقدار آنتی بادی نمونه بيشتر باشد آنتی بادی نشاندار کمتری به چاهک ها متصل شده و سيگنال نيز کمتر خواهد بود و در نتيجه منحنی استاندارد نيز معکوس می باشد ، شاخص ترين مثال برای اين روش اندازه گيری آنتی بادی بر ضد HBc ( HBc Ab ) است .

Direct ELISA

در روش مستقيم آنتي ژن يا آنتي‌بادي مورد نظر به طور مستقيم بر سطح فاز جامد پوشش داده مي شود و سپس آنتي‌بادي يا آنتي ژن مكمل نشاندار شده آن به سيستم اضافه مي‌شود. با آناليز سيگنال توليد شده مي‌توان پي به وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه برد. اين روش ارزش تشخيصي چنداني نداشته و بيشتر كاربرد تحقيقاتي دارد. تست الایزای مستقیم یک تیپ ساده ای از الایزا است که آنتی ژن های جذب شده در سطح پلیت های پلاستیکی قرار دارند و سپس پروتئین دیگر مثل آلبومین سرم گاوی اضافه می شود تا تمام نواحی اتصالی را بلاک کند تا آنزیم ها تنها به آنتی بادی ها در واکنش جداگانه ای متصل شوند. کمپلکس آنزیم –آنتی بادی شستشو داده می شود آنزیم –آنتی بادی متصل به آنتی ژن باقی می ماند. بوسیله اضافه کردن آنزیم به سوبسترا سیگنال های قابل تشخیص را ایجاد می نماید در مقایسه با الایزا غیر مستقیم مراحل ساده تر است اما یک اختلاف مهم و یک مرحله اضافی وجود دارد بعد از اینکه آنتی ژن بوسیله سطح پلیت جذب شد آنتی بادی بعدی به آنتی بادی که آنتی ژن را شناسایی می کند اضافه می شود سپس یک آنزیم –آنتی بادی متصل به پلیت اضافه می شود و آنتی بادی که بوسیله آنتی ژن جذب شده شناسایی می شود .روش مستقیم سریعتر است چون فقط یک آنتی بادی استفاده می شود و مراحل کمتر است

معایب : آنتی بادی اولیه باید به طور جداگانه لیبل شود که می تواند زمان بر باشد اگرچه غیر قابل انعطاف و دارای سیگنال های ضعیف است

Indirect ELISA

در روش غير مستقيم سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي پوشش داده شده در فاز جامد اضافه مي شود، سپس نمونه را به آن اضافه كرده و پس از گذشت زمان انكوباسيون و يك مرحله شستشو، آنتي هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي شود. اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي يا تيتراسيون آنتي بادي در سرم استفاده مي‌شود. ‌در الایزای غیر مستقیم 2 مرحله دارد که 2 پروسه اتصال درگیر است آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه لیبل شده .آنتی بادی اولیه با آنتی ژن انکوبه می شود و سپس با آنتی ژن ثانویه انکوبه می شود اگرچه منجر به سیگنال های غیراختصاصی واکنش های متقاطع می شود

• پلیت ها با آنتی ژن انکوبه می شوند سپس شستشو و با آلبومین سرم گاوی فضاها پر می شوند

• نمونه ها با آنتی بادی ها اضافه و شستشو می شود

• آنزیم متصل به آنتی بادی ثانویه اضافه و شستشو می شود

• سوبسترا اضافه می شود و آنزیم روی آنتی بادی باعث سیگنال های رنگی یا فلورسنتی می شود

مزایا :

• حساسیت بالا : بیشتر از یک آنتی بادی لیبل شده به مولکول آنتی ژن متصل می شود

• انعطاف پذیری : آنتی بادی های تشخیصی اولیه متفاوت می توانند با یک آنتی بادی ثانویه لیبل شده به کار روند

• صرفه جویی در هزینه : کمترین آنتی بادی های لیبل شده مورد نیاز است

در روش غیر مستقیم نمونه آنتی بادی بین آنتی ژن کد شده روی پلیت و آنزیم لیبل شده قرار می گیرد آنزیم ها باعث فعالیت رنگی شده که میزان رنگ ارتباط متناسبی با میزان باند های آنتی بادی ها نمونه دارد حضور آنتی بادی های بیشتر رنگ های قوی تر ایجاد می کند این روش برای تشخیص سطح کلی آنتی بادی در نمونه است

مزایای ELISA :

در مقایسه با سایر متد های ایمونواسی ،‌مزایای زیادی برای استفاده از ELISA وجود دارد

حساسیت بالا ، اختصاصیت : حساسیت بالا به خاطر گروه آنزیمی است که واکنش های رنگی به راه می اندازد و در حد نانو و میکرو گرم است روابط مکملی بین اپی توپ و پاراتوپ آنتی ژن ها باعث ایجاد روابط قوی می شود .

ELISA Device

بیشتر پلیت هایی که در ELISA استفاده می شوند از جنس پلی استرن یا مشتقات آن هستند که بوسیله تغییرات شیمیایی به وجود می آید اغلب برای پلیت های 96 تایی با 8 تا ردیف و 12 ستون طراحی شدند هر چاهک تقریبا350 میکرولیتر حجم دارد با ناحیه داخلی 2.5 cm²  می باشد اخیرا پلیت هایی با 384 و 1539 چاهک با ابعاد پلیت های 96 تایی درست شده اند و چاهک هایی با انتهای گرد طراحی شده اند که به جای انتهای با زوایای 90 درجه که باعث بهتر انجام شدن مراحل شستشو   می شوند گزارشات افزایش 10-20 ٪ در جذب IgG در چاهک های ستاره ای نشان داده شده است بعلاوه پلیت های غیر کد شده تغییرات متفاوتی در آمین ها ایجاد می کنند یا گروه هایmaleimide, hydrazine  یاN-oxysuccinimide روی سطح فعال می کنند که بتواند برای اتصالات کوالان پروتئین ها به کار رود .

 ویژگی پلیت های الایزا :

تک کاناله با حجم ثابت و حجم متغیر(1–20 μL, 10–100 μL, 20–200 μL, etc.)

چند کاناله : 8-12 کاناله

قابل نیمه اتوکلاو

سیستم های کامل اتوماتیک که برای پلیت های چندتایی به کار می رود

Washer Systems

• سیستم های دستی که یک ستون یا ردیف را در یک زمان می شوید

• سیستم های نیمه اتوماتیک که شستشوی یک استریپ یا پلیت را همزمان انجام می دهد

• سیستم های تمام اتوماتیک که شستشوی پلیت های چند تایی را همزمان انجام می دهد

از ديگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است كه در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخليه كامل مولكول‌هاي غير اختصاصي از محيط واكنش انجام مي گيرد. شستشو به دو صورت دستي و خودكار انجام مي شود. ابتدايي ترين روش شستشو، شستشوي دستي است بدين ترتيب كه مايع شستشو را با پيپت بر روي چاهك ها ريخته و سپس آن را در سينك خالي مي كنند. فشار بالاي شستشو در روش دستي كه به علت تخليه سريع بافر به وجود مي آيد، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصي از كف چاهك‌ها و كاهش كاذب مي‌شود، همچنين فشار پائين‌شست‌شو ناشي از تخليه آهسته بافر، باعث عدم دفع كامل اتصالات غير اختصاصي و افزايش كاذب جذب نوري مي‌شود. بهتر است در روش دستي تا نزديك لبه فوقاني چاهك ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهك‌ها، احتمال آلودگي چاهك به چاهك افزايش پيدا مي‌كند. همچنين بايد از سرريز شدن محلول شستشو، ايجاد حباب هوا در چاهك‌ها و تماس با كف چاهك جلوگيري كرد. در هنگام تخليه چاهك‌ها نيز بايد مكش و تخليه به طور كامل انجام شده و دقت شود كه حتي ذره اي از مايع بافر در كف چاهك‌ها باقي نماند. اما اين روش شستشو (شستشوي دستي) بسيار وقت گير بوده و خطر آلودگي محيط و كاربر را در پي دارد. از اين رو دستگاه‌هاي خودكار واشر     ELIZA براي شستشوي پليت ها به وجود آمده است كه علاوه بر دقت و ايمني بالاتر، سريع‌تر و راحت‌تر عمل شستشو را انجام مي دهند. اين دستگاه‌ها در انواع مختلف 8 يا 12 كاناله، تك سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع دو سوزنه، يك سوزن براي ريختن و ديگري براي خالي كردن محلول شستشو استفاده مي‌شود بدين ترتيب كه يك سوزن به طور دائم در حال مكش است تا اگر مايع شوينده بيشتري در هنگام پر كردن وارد چاهك ها شد ، آن‌را خالي كند و اين در حالي‌است كه در مدل تك سوزنه تمامي اقدامات توسط همان يك سوزن صورت مي گيرد. اين دستگاه ها بسيار موثر و تقريباً سريع بوده و توسط افراد مجرب مورد استفاده قرار می گيرند.

ELISA Plate Readers

• ریدر های دستی که یک ردیف یا چاهک را می خواند

• ریدر های نیمه اتوماتیک که یک پلیت را در یک زمان می خواند

• سیستم های تمام اتوماتیک که خوانش پلیت های چندتایی را همزمان انجام می دهد

خوانشگر ELISA در واقع يك دستگاه فتومتر است كه در آخرين بخش از تست ELISA به طور اختصاصي براي خواندن نمونه هاي مربوطه طراحي شده است. وظيفه آن طيف‌سنجي نوري يا خوانش دانسيته نوري واكنش ELISA است. طول موج مشخصي از نور از پائين درون چاهك مي‌گذرد، در مسير آن فيلتر مناسبي باتوجه به نوع آنزيم و نوع سوبستراي آنزيم جهت دستيابي به طول موج مطلوب قرار داده مي شود. در بسياري از خوانشگرها سيستم تك موج يا دو موج است و جهت برطرف سازي نقص سيستم نوري ، تغييرات چاهك به چاهك حجم نهايي در چاهك ها، تصحيح جذب نوري به طور خودكار صورت مي گيرد . اين عمل توسط نوع خاصي از فيلترتحت عنوان فيلترهاي تفاضلي صورت مي گيرد. خوانش ميزان جذب محتوي چاهك‌ها توسط خواننده ELISA الزاما بايستي در زمان تعيين شده انجام شود. بعضي از دستگاه‌هاي خواننده ELISA قابليت برنامه‌ريزي زماني، نوع تشخيص و كنترل و در نهايت مشخص كردن مثبت يا منفي بودن نمونه‌هاي مجهول را دارا هستند. ‌
امروزه انواع مختلفي از خوانشگرها براي پليت ها ي ELISA در بازار موجود هستند اكثر اين خوانشگرها يك ستوني يا 96 خانه (يك پليتي) بوده كه اكثرا خودكار و تعداد اندكي نيز دستي هستند. اين دستگاه‌ها داراي فيبرهاي نوري هستند. در دستگاه‌هاي خواننده انتخاب طول موج توسط فيلترها يا گريدها (گريتينك ساختارهايي كه با تابيده شدن نور به آن‌ها، تنها نور با طول موج خاصي ازآن‌ها ساطع مي شود) انجام مي شود. براي چاپ نتايج نمونه‌هاي موردآزمايش ، يا دستگاه خود داراي پرينتر است يا مي توان آن‌را به پرينتري متصل كرد. همچنين مي توان جهت انجام محاسبات بيشتر خوانشگر ELISA را به كامپيوتر وصل كرد.

شيكر ELISA SHAKER) ELISA)

Shaker Eliza

تكان دادن ميكروپليت ها( shaking) از مهم‌ترين بخش هاي تكنيك ELISA است، چرا كه تاثير زيادي در تغيير رنگ محيط آنزيمي پس از افزودن محلول اسيدي دارد. استفاده از روتاتور معمولي با قطر چرخش زياد و تعداد دور كم و در نتيجه تكان دادن آهسته ميكروپليت‌ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف‌ها و در نتيجه ادامه و پيشرفت جزئي واكنش در طي زمان و بروز خطا مي‌شود. همچنين تكان شديد اين پليت ها نيز باعث آلوده شدن چاهك هاي ميكرو پليت با هم مي‌شود. شيكر ELISA دستگاهي است كه براي مخلوط كردن محتويات ميكروپليت‌ها به كار گرفته مي شود. شيكر ELISA با حركت سريع با قطر چرخش كم باعث اختلاط مناسب معرف‌ها و در نتيجه پيشرفت واكنش در طي زمان مي‌شود. شيكرهاي امروزي مجهز به سيستم كنترل زمان و كنترل دور به صورت ديجيتال است.

ELISA Reagents

سه ماده ضروري براي معرف هاي الايزا شامل :

immunosorbent, conjugate و substrate است تمام اين محتويات براي يك كيت و تشخيص توسط الايزا ضروري است

1- Immunosorbent فاز جامدي كه روي آن بوسيله آنتي بادي يا آنتي ژن كد مي شود و در دماي پائين 2-8 درجه قابل نگه داري مي باشد و در شرايط بدون رطوبت براي 6 ماه قابل نگهداري است كيت هايي وجود دارد كه آنتي بادي و آنتي ژن هاي كد شده را مي تواند نگهداري نمايد و بعنوان كنترل استفاده مي شود . در تست هاي الايزا وظيفه فاز جامد جذب و حمل كننده است بنابراين خودش واكنش دهنده نيست . مواد زيادي وجود دارد كه معمولا از جنس پلي استرن است كه براي الايزا مي توان از آن استفاده كرد و قدرت زيادي براي جذب پروتئين ها دارد و آنتي بادي يا پروتئين هاي آنتي ژني بعد از جذب فعال روي آن باقي مي مانند . بعلاوه به طور وسيعي كاربرد دارد چون ارزان قيمت است . پلي استرن يك ماده پلاستيكي است كه مي تواند به شكل هاي مختلف ساخته شود

سه شكل از حامل هاي الايزا وجود دارد :

microtiter plate و small ball , small tube

معمولا microtiter plate 96 خانه استفاده مي شوند . از ويژگي پليت هاي الايزا اين هست كه مي تواند براي تشخيص حجم زيادي نمونه در يك زمان استفاده شود و نتيجه سريع بوسيله رنگ سنجي محاسبه شود پلي استرن در جذب پروتئين قدرتمند است معمولا ايمونوگلبولين ها بعد از پرتودهي ،‌مي تواند آنتي بادي ها را در فاز جامد افزايش دهند .يك پليت الايزا خوب جاذب قوي است با فاصله هاي كم و شفافيت بالا در ته چاهك ها

• Conjugate (Antigen or antibodies conjugated enzyme)

• اساس روش های سنجش ايمنی

• مزايای IEMA نسبت به EIA :

كانجوگيتيو ها آنتي بادي ها يا آنتي ژن هايي هستند كه به آنزيم متصل شده اند و ماده كليدي در الايزا مي باشد يك كانجوگيتيو خوب تنها فعاليت كاتاليتيكي آنزيمي ندارد همچنين توانايي ايمونولوژيكي آنتي بادي ها را هم داراست . آنتي بادي يا آنتي ژن بخشي از آنزيم هستند كه به ترتيب آنزيم ها و آنتي بادي هاي غير لينك شده را كاهش مي دهد . بعلاوه كانجوگيتو ها بايد در حد مطلوب پايدار باشد.

 اگر كيت هاي درخواستي شما محلول هاي كانجوگيتو آماده استفاده را داشته باشد مطمئنا ساختار راحتي را دارند فقط چيزهايي كه سريع به آن نياز داريد را آماده كنيد و باقي محلول ها را براي استفاده بعدي نگه نداريد اگر كانجوگيتو ها آلوده شوند يا در انبار بد نگهداري شوند آنها فعاليت آنزيمي خود را از دست مي دهند يا ممكن است افزايش در جواب ها ايجاد شود بيشتر كيت ها محلول هاي آماده دارند

1-آنزيم

آنزيم هايي كه در ELISA استفاده مي شوند بايد خلوص بالا ، نرخ تبديل بالا ، اختصاصيت مناسب ، خواص پايدار ، منبع غني ،‌قيمت ارزان و اجزاء فعال ،‌خاصيت كاتاليتيكي بعد از اتصال به آنتي بادي بايد داشته باشد سوبسترا هاراحت ساخته و نگهداري مي شوند محصولات فاقد آهن خيلي راحت تشخيص داده مي شود . در الايزا HRP و الكالين فسفاتاز معمولا استفاده مي شود

2-آنتي ژن و آنتي بادي

IgG استخراج شده زياد ، معمولا در كانجوگيتو استفاده مي شود و بترتيب از مداخله ساير پروتئين ها زمانيكه متصل به آنزيم هستند ممانعت مي كند بهترين روشي براي استخراج آنتي بادي ها از طريق كروماتوگرافي است . اين آنزيم ها كونجوگه شده تماما اختصاصي از اجزا ايمونولوژي هستند و مي توانند در غلظت هاي پايئن واكنش دهند

سوبسترا :

فعاليت شيمايي سوبسترا مي تواند در معرض نور يا در تماس با فلزات به خطر بيفتد . حمايت اين محلول ها بوسيله نگهداري در ظروف تاريك تا زمان انجام كار لازم است

 كنترل ها :

بيشتر كيت ها داراي كنترل هاي از پيش رقيق شده هستند اگرچه بعضي از آنها نياز دارند كه به شكل يكساني با نمونه رقيق شوند. كنترل ها بايد به پليت با روشي يكسان و همزمان با نمونه اضافه شوند

رقت نمونه ها و محلول هاي شستشو :

مطمئن شويد كه رقت نمونه ها و محلول هاي شستشو با دماي اتاق (18–25°C) قبل ار استفاده هم دما شده است آنها معمولا در بطري هاي بزرگ در يك كيت قرار دارند و بيشترين مواقعه موازنه است اگر محلول شستشو مواد كريستالي داخلش بود بعد از رسيدن به دماي اتاق ، آن را بوسيله تكان دادن بطري براي چند بار مخلوط كنيد در پليت الايزا 0.05توئين ٪20 PBST به طور معمول براي رقيق كردن استفاده مي شود

محلول متوقف كننده :

از وجود محلول متوقف كننده در كيت مطمئن شويد .هر اقدام پيشگيرانه يا احتياطي را كه در كيت ذكر شده انجام دهيد اين محلول قبل از استفاده بايد به دماي اتاق برسد اگر محلول متوقف كننده مواد كريستالي داخلش بود بعد از رسيدن به دماي اتاق ، آن را بوسيله تكان دادن بطري براي چند بار مخلوط كنيد محلول متوقف كننده ممكن است در دماي پائين به فرم كريستالي در بيايد قبل از استفاده كامل آنها را حل كنيد و ظاعر شفاف آن را بررسي كنيد H2SO4 به طور وسيعي به عنوان محلول متوقف كننده استفاده مي شود غلظت آن به ميزان حجم نهايي محلول بستگي دارد معمولا 2 mol/L در پليت الايزا استفاده مي شود .

ELISpot Schematic Procedure

نتايج ELISA به صورت عددي گزارش مي‌شود. بحث‌انگيزترين وجه اين تست تعيين نقطه برش بين نتايج مثبت و منفي است.
علاوه بر آزمايش HIV از ELISA براي آزمايش بيماري‌هايي چون هپاتيت، تب استخوان‌شكن، leptospirosis ، عفونت انگلي، تبخال، سرخجه و ديگر عفونت‌هاي ويروسي و باكتريايي استفاده مي‌شود.

 پيش از پيدايش روش ELISA ، تنها گزينه براي انجام سنجش ايمني، ايمني سنجي راديويي بود، كه از آنتي ژن ها و آنتي بادي هايي كه به صورت راديواكتيو مميز شده بودند استفاده مي‌شد. در اين روش در صورت وجود آنتي بادي يا آنتي‌ژني خاص، راديواكتيويته سيگنالي توليد مي‌كرد. تئوري روش ايمني سنجي راديويي اولين بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجايي‌كه راديواكتيويته خطرات زيستي داشت، پيشنهاد امن تر و ايمن تري مبني بر جايگزيني سيگنال هاي غير راديو اكتيو به جاي سيگنال هاي راديو اكتيو ارائه شد. وقتي يك آنزيم مشخص (مانند پر اكسيداز) با زير لايه مناسب واكنش مي دهد، منجر به تغيير رنگ آن مي‌شود كه مي تواند به عنوان سيگنال استفاده شود. البته بايد تناسب بين سيگنال و وجود آنتي‌بادي يا آنتي ژن تعيين مي‌شد كه اين پروسه توسط StratisAvrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath اين روش تكميل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهايتا به روش ELISA به شيوه امروزي دست پيدا كردند. ELISA امروزي مزاياي زيادي نسبت به روش‌هاي ايمني سنجي راديويي دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امكان اتوماسيون، امكان افزايش حساسيت روش، عمر طولاني كيت هاي آنزيمي، سرعت خوانش بالا و قيمت ارزان‌تر دستگاه‌ها و معرف ها.

فرایند انجام ELISA :

براي انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آن‌ها بايد در دماي­C 8-2 صورت گيرد. تمامي محلول‌هاي موجود در كيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين كاذب مي‌شود لذا توصيه مي‌شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود.

 از آنجا كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها مي‌شود، بايد تا حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه‌گيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي يكبار مصرف پيشنهاد مي‌شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشه‌اي آن‌ها را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي انجام داد. از به كار بردن محلول‌هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاه‌ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل كرد.

براي انجام الايزا:

• ابتدا بايد پروتئين مورد نظر را به كف پليت چسباند.

• نقاط اتصال باقي مانده را بايد با محلول پروتئيني مناسب مسدود كرد.

• محلول مورد آزمايش را اضافه كرد تا دو ماده همديگر را پيدا كرده و متصل شوند

• سيستم هاي تقويتي اوليه را براي افزايش حساسيت آزمايش بكار گرفت

• سيستم آنزيمي نهايي را به راه انداخته و رنگ نهايي توليد شده را اندازه گرفت

حال اين 5 مرحله به تفكيك توضيح داده مي شوند:

1 ) اتصال پروتئين به كف پليت (Coating):

آنتي ژن (يا آنتي بادی) در مقاديری در حدود ميکروگرم به داخل چاهک پليت الايزا اضافه شده و فرصت داده ميشود تا به مقدار کافي به کف چاهك (well) متصل شود براي اينكار بسته به نوع پروتئين بافرهاي مختلفي به كار گرفته مي شود و غلظت پروتئين نيز بايد مناسب سازي شود در مقادير بسيار پايين حساسيت رديابي پايين مي آيد و در مقادير بالاي آنتي ژن اتصالات سستي نيز برقرار ميشود كه در مراحل بعدي كنده شده و هنگام شستشو آنتي ژن همراه با آنتي بادي اختصاصي

 دفع مي شوند و لذا حساسيت تست مجددا پايين مي آيد.بطور كلي اين مرحله اساسي بوده و نقش زيادي در نتيجه نهايي دارد ايده آل هاي مورد انتظار براي اين مرحله اينها هستند:

الف) مقدار آنتي ژن متصل شده به كف همه چاهك هاي يك پليت بايد يكنواخت باشند و كمترين واريانس را در نتيجه ايجاد كنند، بدين معني كه وقتي يك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمايش كنيم بايد نتايج بدست آمده به هم نزديك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنين اگر آزمايش مورد نظر در حجم بالا انجام ميگيرد و چند پليت را هم زمان كد نموده و استفاده ميكنيم بايد جنس پليت ها و شركت تهيه كننده آنها يكسان باشد تا از خطاي مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيري شود و ترجيحا بافر كوتينگ و زمان كوتينگ و محلول آنتي ژني آماده شده براي كوتينگ بهتر است يكسان باشند.

ب) اتصالات برقرار شده بين آنتي ژن و بستر جامد بايد به اندازه كافي محكم و قوي باشند تا در مراحل شستشوي بعدي كنده نشوند، معمولا براي آنتي ژن هاي عادي، اتصال دهنده اضافي لازم نيست ولي اگر آنتي ژني استثناً با روش معمول به كف پليت نچسبيد يا اتصالات سستي برقرار كرد از مواد و روش هاي خاصي براي اتصال آنتي ژن به كف بستر استفاده مي شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايكس يا …).

ج) پروتئين متصل شده نبايد آنقدر كم باشد كه نتواند مقادير بالاي آنتي بادي را جذب كند در اين صورت غلظت هاي بالاي آنتي بادي قابل تشخيص نخواهد بود از طرفي پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد كه اتصالات غيراختصاصي از اتصالات اختصاصي بيشتر شوند كه در اين صورت جواب آزمايش قابل اعتماد نخواهد بود

براي تامين اين سه هدف تمهيدات خاصي به كار گرفته مي شوند كه در فرصتي مناسب توضيح داده خواهند شد

2 ) مرحله مسدود سازي يا بلوكينگ (blocking):

نقاطي از كف پليت كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند با استفاده از محلول هاي پروتئيني خنثي (از اين نظر كه در  واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) پوشانده مي شوند محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاوی يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 يا … نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند و با توجه به تجربيات ديگران مي توان محدوده خاصي را براي كار مورد نظر امتحان كرد و بهترين غلظت را بدست آورد (چون پروتئين ها از ريشه هاي جانبي متفاوتي برخوردارند لذا براي پروتئين هاي بسيار خالص مثل پروتئين هاي ريكامبينانت مناسب سازي اين تركيبات در بالا بردن اعتبار نتايج بسيار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال انتخابي پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئيني) ميتوان بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت را ارزيابي كرده و بهترين بافر را براي آزمايش مورد نظر بدست آورد.

3 ) اتصال آنتي ژن و آنتي بادي

محلول مورد آزمايش كه احتمال ميرود حاوي مقادير قابل رديابي از آنتي بادي بر عليه آنتي ژن اختصاصي موجود در كف پليت ميباشد در اين مرحله در بافر مناسبي تهيه شده و اضافه مي شود آنتي بادي شناور در محلول، آنتي ژن متصل به بستر را پيدا كرده و به آن متصل مي شود بندرت اين آنتي بادي متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزيم دار در مرحله بعدي بكار گرفته مي شود.آنتي بادي هاي متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف مي شوند بافر شستشو معمولا داراي پروتئين خنثي به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. و از نظر قدرت و pH بافري مناسب براي اتصال آنتي ژن با آنتي بادي است. آنتي بادي ها، سرم ، و محلولهاي بكار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق مي شوند.

4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه

 سيستم تقويتي اوليه قبل از سيستم تقويتي اصلي (كه همانا بكار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست) ميباشد در اين مرحله ما واكنش هاي اضافه تري را به كار ميگيريم تا قدرت اندازه گيري تست (حساسيت و اختصاصيت) بالا برده شود.بدين منظور از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين-استرپتاويدين، لكتين-ليگاند و … استفاده مي شود.

5 ) تقويت آنزيمي

هر آنزيمي بر روي سوبستراي اختصاصي خود اثر كرده و آنرا به محصول تبديل مي كند اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند اين اثر افزايشي در حقيقت اساس الايزا را تشكيل ميدهد. بدين ترتيب كه آنتي بادي نهايي باقي مانده پس از شستشوي نهايي با مولكول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طي زمان معيني (مثلاً يك ساعت) منجر به آزاد سازي مقادير متنابهي سوبسترا مي گردد كه يا خود رنگي ميباشد يا در واكنش با ماده ديگري (كروموژن يا رنگزا) كه به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميكند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصي خوانده شده و محاسبات لازم بر روي داده هاي بدست آمده انجام مي گيرد

اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گيری سيتوکين

در روش الايزاي ساندويچي مولكول اندازه گيري شده در واقع در بين دو مولكول مختلف آنتي بادي قرار ميگيرد (ساندويچ ميشود) مثلا اين روش را در مورد اندازه گيري سايتوكاين اينترفرون گاما شرح ميدهيم:

سلول های طحالي گرفته شده از موش های دريافت کننده واکسن در اثر تحريک با آنتي ژن اختصاصي در محيط کشت تکثير پيدا خواهند کرد برای تعيين اينکه غالب سلول های تکثير يابنده از نوع Th1 هستند يا Th2 بايد پروفيل سيتوکيني در محيط کشت مشخص شود بدين منظور تعيين مقدار سيتوکين های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محيط کشت مد نظر قرار ميگيرد.

 چنانكه در شكل زير مشخص شده است در اين روش آنتي بادی منوکلونال ضد آنتي ژن به کف plate چسبانده ميشود سپس فرصت داده ميشود تا آنتي ژن (در اين تحقيق سيتوکين IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتي بادی پلي کلونال ضد آنتي ژن اضافه ميشود که متصل به آنزيم پراكسيداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ايجاد محصول رنگي ميشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت ميگردد چون در اين روش آنتي ژن در بين دو آنتي بادی قرار ميگيرد لذا به ساندويچ مشهور شده است. تصوير زير گوياي اين شباهت است.

نتیجه گیری :

در ابتدای نيمه ی قرن بيستم ، محصول ايمنی همورال يعنی آنتی بادی ها يکی از نقاط عطف در مقوله ی روش های سنجش را بوجود آوردند . آنتی باديها با اتصال ويژه به آناليتی که بر ضد آنها تهيه شده اند ، به عنوان ابزاری مناسب برای سنجش های ويژه و سريع در اختيار محققان قرار گرفتند . روش هايی که از آنتی باديها به عنوان فاکتور شناساگر بهره می گيرند ، روش های سنجش ايمنی نام دارند .

تمامی سنجش های ايمنی که بر اساس واکنش تعادلی و غير کووالانسی بين ايمونوگلوبولين و آناليت ها بنا شده اند ، در اصل از مهمترين روش های سنجش اتصال ليگاند به شمار می آيند . بر هم کنش آنتی بادی با آناليت عمدتاً از نوع هيدروژنی و واندروالس است . اين بر هم کنش ناشی از مکمل بودن شکل فضايی ناحيه متغير آنتی بادی با بخشی از ساختمان آناليت می باشد . اغلب ، آنتی بادی های پلی کلونالی که در سنجش های ايمنی بکار می روند از نوع IgG هستند .

بر هم کنش ميان آناليت و آنتی بادی فيزيکی است ، يعنی تغيير شيميايی در ساختمان آناليت يا آنتی بادی بوجود نمی آيد . به هر حال واکنش ويژه ميان آناليت و آنتی بادی اساس کليه روش های سنجش ايمنی می باشد . به منظور رديابی واکنش مذبور از سيگنال دهنده های مختلفی بهره گرفته اند . مثلاًاستفاده از ماده ی راديو اکتيو سنجش های RIA ، IRMA و استفاده از سيگنال دهنده های آنزيمی سنجش های EIA ، IEMA را بوجود آورده است .

 شناسايی آناليت ، اولين مرحله در اين نوع سنجش محسوب می شود . اين عمل توسط آنتی بادی انجام می پذيرد . به عبارتی ، جزء لا ينفک هر سنجش ايمنی واکنش ميان آنتی ژن و آنتی بادی است . در محدوده ی معينی از غلظت آنتی ژن و آنتی بادی انجام واکنش منجر به تشکيل رسوب قابل رويت ( قبل يا بعد از رنگ آميزی ) می گردد . اما در اغلب موارد ، قبل و بعد از انجام واکنش آنتی ژن و آنتی بادی تغيير قابل مشاهده ای وجود ندارد ، به همين دليل وجود سيستم نشانه گذاری ضروری به نظر می رسد . نوع طبقه بندی سنجش های ايمنی آنزيمی بر اساس نوع نشاندار سازی است . همانطو که اشاره شد در اين روش نيز می توان جهت رديابی واکنش ، آنتی ژن و ِيا آنتی بادی را با آنزيم نشاندار ساخت . به عمل نشاندار سازی ، کونژوگاسيون و به مولکول آنزيم دار ، کونژوگه ی آنزيمی نيز می گويند . چنانچه آنتی ژن کونژوگه گردد روش را EIA( Enzyme Immuno Assay ) گويند و اگر آنتی بادی کونژوگه گردد روش را  IEMA( Immuno Enzymo Meteric Assay ) می نامند .

اساس روش EIA ، رقابت ميان آنتی ژن کونژوگه و آنتی ژن آزاد در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی بادی است . در اينجا ميزان کمپلکس آنزيم دار با آنتی ژن آزاد رابطه معکوس دارد . لذا می توان بسته به نياز آنتی بادی های پلی و يا مونو کلونال استفاده کرد . البته در برخی سنجش ها آنتی بادی های اليگو کلونال پاسخ بهتری ايجاد می کنند . چنانچه چند نوع آنتی بادی مونو کلونال را با هم مخلوط کنيم ، مجموعه حاصله را آنتی بادی اليگو کلونال می باشد

• سادگی نشان دار کردن

• سرعت بيشتر واکنش

• افزايش حساسيت

• محدوده ی وسيع تر از غلظت آناليت

• ويژگی بالاتر

• مقاومت بيشتر در برابرشرايط آزمايش

برخی از مزايای روش های سنجش ايمنی آنزيم دار نسبت به سنجش ايمنی راديو اکتيو :

• عدم وجود خطر تشعشع

• امکان اتوماسيون

• قيمت ارزانتر دستگاه ها

• سرعت خوانش بالا

• معرف های ارزان

• امکان افزايش حساسيت روش

• نيمه عمر طولانی کيت های آنزيمی

• متغير ها قبل از سنجش

• متغير های وابسته به نمونه

• تاثير معرف ها ( Reagents Effect )

• تاثير پروتئين ها :

• پروتئين های هورمون گير داخلی :

تمامی عواملی که قبل از انجام آزمايش و زمان انتخاب نوع نمونه ، شيوه نمونه گيری نگهداری و ارسال آن بر نتيجه سنجش تاثير داشته باشند را متغير های قبل از سنجش گويند

اين متغير ها بر دو نوع هستند:     1 – متغير های وابسته به بيمار              2 – متغير های وابسته به نمونه

توجه داشته باشيد که عواملی مانند زمان نامناسب نمونه گيری يا فاکتور های محيطی مانند سيگار کشيدن هر چند که آزمايش را تحت تاثير قرار می دهند اما به عنوان عامل مداخله گر نيستند .

محکم بستن يا طولانی شدن مدت تورنيکت بر روی وريدها باعث افزايش فشار و خروج مايعات از وريدها به فضای ميان بافتی گرديده ، غلظت برخی از آناليت ها را افزايش می دهد مثلاً اين شرايط باعث 5% افزايش در ميزان پروتئين فرد می شود و به تبع آنها ليگاندهای متصل به آنها نيز افزايش ميابد .

 ماهيت نمونه : تقريباً تمام سنجش های ايمنی از سرم به عنوان نمونه مورد بررسی استفاده می کنند . در مواردی که بيمار نياز به آزمايشاتی مانند CBC دارد وجود پلاسما آزمايشگر را تشويق می کند تا از نمونه گيری مجدد پرهيز کند و از پلاسما به عنوان نمونه مورد سنجش استفاده نمايد . هر چند در اغلب سنجش های ايمنی تفاوتی ميان نتايج سرم و پلاسما وجود ندارد اما به هر حال با توجه به تفاوت زمينه ( Matrix ) اين دو نمونه ، اعتبار جايگزينی پلاسما به جای سرم بايد اثبات شده باشد .

استفاده از پلاسمايی که از ليتيم هپارين ( Li . Hep ) به عنوان ضد انعقاد در مورد آن استفاده شده در اکثر موارد قابل قبول است اما در مورد پلاسمايی که از EDTA به عنوان ضد انعقاد استفاده کرده اند بايد با احتياط بيشتری رفتار شود . آلودگی نمونه ها می تواند منشا خطا در سنجش باشد . وجود غلظت های بالای هموگلوبين در نمونه های هموليز با بر هم کنش پروتئينی در به تعادل رسيدن واکنش آنتی ژن _ آنتی بادی تداخل ايجاد کرده ، زمان به تعادل رسيدن را افزايش می دهد . اغلب آناليت ها پايداری خوبی دارند و حتی اگر گويچه های خونی از سرم جدا نشوند می توان بسته به نوع آناليت چند روز اين نمونه را در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . به عنوان مثال هورمون های ، TSH ، FT4 ، PRL ، LH ، FSH و PSA در نمونه سرمی به مدت دو هفته در دمای 4 درجه سانتی گراد پايدار می مانند .

قدرت يونی و PH بافر ها بسيار مهم است . خصوصاً زمانی که از آنتی بادی های مونوکلونال با PH ايزوالکتريک بين 5 تا 9 استفاده می شود . استفاده از PH و قدرت يونی مناسب ، اتصال غير ويژه به جداره ظرف واکنش را به حداقل می رساند . معمولاً در بافرها از مقدار کمی پروتئين و دترژانت برای کاهش اتصال غير ويژه بهره گرفته می شود و اين عمل به افزايش دقت کمک می کند . استفاده از جابجا کننده ها ( Displacers ) سبب جدا شدن مولکول های آنتی بادی با اتصال ضعيف می شود . از آنجائيکه آنتی بادی ها معمولاً با پيوند غير کووالانس به سطوح جامد متصل می شوند ، استفاده از مقادير کنترل شده دترژان به کم شدن اتصالات غير ويژه کمک می کند اما اگر ميزان آن از حد معينی بيشتر شود سبب دناتوره شدن آنتی بادی ها و جدا شدن آنها از سطوح جامدی می شود که بر روی آن تثبيت شده اند.

 برخی از دترژانت ها به دليل مسير واکنش سنتزشان ، حاوی پراکسيدهايی می باشند که قادر به تخريب واکنش آنتی ژن _ آنتی بادی هستند . از آنجائيکه محيط های بافر اغلب برای رشد ميکروارگانيسم ها بسيار مناسب هستند ، در صورتيکه ترکيبات نگهدارنده به محيط افزوده نشود مورد هجوم ساپروفيت ها و باکتری ها قرار می گيرند اما بايد مراقب بود که برخی از اين نگهدارنده ها مانند آزيد سديم در بخش های ايمنی آنزيمی که از پراکسيداز ها استفاده می کنند ، مهار کننده محسوب می شوند. مهمترين پروتئين هايی که سبب تداخل در برخی از سنجش های ايمنی می شوند ،عبارتنداز آلبومين ، فاکتور روماتوئيد ، کمپلمان ، ليزوزيم و فيبرينوژن .

اينگونه پروتئين های هورمون گير با غلظت های متفاوت در تمام سرم ها و پلاسما ها وجود داشته ، می توانند منشا تداخل در سنجش های ايمنی باشند . هم نوع و هم غلظت اين پروتئين ها تحت تاثير عوامل ارثی و اکتسابی قرار دارند . از ميان اين پروتئين ها آلبومين اهميت زيادی دارد چرا که هم بيشترين غلظت را داشته و هم به طيف وسيعی از آناليت ها از جمله هورمون ها متصل می گردد . برخی از پروتئين های هورمون گير عبارتند از :

1 ) گلوبولين تيروکسين گير

2 ) گلوبولين کورتيکو استروئيد گير

3 ) گلوبولين گيرنده هورمون جنسی

4 ) آلبومين

5 ) پره آلبومين

6 ) ترنسفرين

يکی از رايج ترين و کارامد ترين روش های جدا سازی در سنجش های ناهمگون استفاده از فاز جامد يا تثبيت يکی از کمپلکس می باشد . با تثبيت آنتی ژن يا آنتی بادی ، کمپلکس به فاز جامد متصل می ماند ، لذا با شستشوی ساده مولکول سيگنال دهنده آزاد از محيط خارج می شود . تاکنون از فاز های جامد متعددی استفاده شده است :

1) دانه های ( Beads ) پلی استيرن

 2 ) لوله های پلی استيرنی با چاهک های ( Wells ) مربوطه

3 ) سلولز

4 ) نايلون

5 ) ذرات مغناطيسی

روش های فوق بسيار ساده و عملی می باشند اما جذب غير اختصاصی مولکول نشاندار يکی از مشکلات اصلی می باشد که خوشبختانه با استفاده از محلول های شستشو گر حاوی املاح دترژانت اين مشکل نيز تا حدود زيادی برطرف شده و در مواردی تثبيت آنتی بادی با کاهش فعاليت آن همراه است . اين موضوع کاربرد اين روش را کمی محدود می سازد .

عوامل ایجاد کننده خطا و مشکلات احتمالی

عوامل قبل از انجام آزمایش

• محکم بستن و یا طولانی بسته بودن گارو در زمان نمونه گیری

• تاثیر ضد انعقادها هنگام استفاده از پلاسما (EDTA  روی آنزیم آلکالین فسفاتاز)

• نمونه همولیز (افزایش Hb و باقی ماندن آن در محیط بعداز شستشودر سنجش هایی که از آنزیم پراکسیداز استفاده میشود تداخل ایجاد میکند)

• نمونه لیپمیک باعث کدر شدن و شیری شدن سرم میشود

• نمونه ایکتریک ( سرم زرد تیره – بیلی روبین بعنوان دترژنت عمل کرده – واکنش با قسمتهای هیدروفوب آنتی ژن و آنتی بادی)

• تاثیر مواد نگهدارنده ( اثر سدیم آزاید روی آنزیمهای پراکسیداز)

• عوامل حين انجام آزمایش

• مقادیر بالای کنترل منفی و یا ایجاد زمینه در میکروپلیت

• مقادیر پایین کنترل مثبت یا جذب نوری پا

• تمام پلیت مثبت تفسیر شود ( در تمام چاهکها محلول دارای رنگ است )

• واکنش مثبت کاذب

• قدرت تکرار پذیری ضعیف یا عدم هماهنگی در جذب نوری دو چاهک دارای نمونه یکسان

• حساسیت ضعیف

• جذب نوری بالا استانداردها و یا کنترل منفی

• نمونه با جذب نوری خارج از محدوده استانداردها

• جذب نوری پایین نمونه ها ، کنترل ها و استانداردها

• کنترل مثبت یا منفی خارج از محدوده تعیین شده توسط بروشور کیت

• خروج استریپ ها از قاب نگهدارنده آنها

• تغییر رنگ کروموژن

• تغییر رنگ مخلوط کروموژن و سوبسترا قبل از افزودن به محیط واکنش

• تغییر رنگ محلول متوقف کننده واکنش

• عدم بروز واکنش رنگی در میکروپلیت پس از افزودن سوبسترا و انکوباسیون آن

No Signal or Weak Signal

• حذف یکی از معرف های کلیدی نظیر کنژوگه در روش اجرائی کار

این حذف منجر به سیگنال منفی ( عدم واکنش ) می گردد. افت تیتر کنژوگه  (غیر فعال شدن کنژوگه) یا کاهش اثر ترکیب سوبسترا و کروموژن که معمولا به دلیل آلودگی معرف ها یا در انتهای مصر ف هر کیت در مراکزی که تعداد نمونه کم بوده و کیت مکررا و در چندین نوبت مورد استفاده قرار می گیرد باعث سیگنال منفی می شود.

• خروج از کالیبر ابزارهای حجمی برداشت نمونه و استاندارد

  این مسئله منجر به کاهش سیگنال نهائی می گردد به عنوان مثال اگر از منحنی استاندارد ذخیره شده در حافظه دستگاه استفاده نمائیم و ابزار حجمی در حین کار از کالیبر خارج گردد به دلیل اینکه تست و استاندارد در هر ردیف کاری همزمان گذاشته نمی شوند در صورت کاهش برداشت حجم نمونه درسیگنال مربوط به تست ها کاهش و ضعف ایجاد می گردد و نتایج منفی کاذب یا مثبت کاذب بسته به نوع منحنی حاصل می نماید.

• خراش در کف پلیت ها می تواند منجر به کاهش سیگنال شود

• کاهش زمان انکوباسیون یا دمای انکوباسیون

بر خلاف دستور العمل کیت منجر به کاهش سیگنال می گردد که به دلیل کاهش تعداد ترکیب های اتصالی نهائی می باشد.

• شستشو بیش از تعداد دفعات تعریف شده

شستشوی زیاد و یا استفاده از بافر با  PHنامناسب یا دچار آلودگی باکتریال و قارچی منجر به دفع واکنش های اختصاصی ایمن کمپلکس و نهایتا افت و کاهش سیگنال یا رنگ نهائی می گردد.

• کاربرد فیلتر نامناسب در الایزا منجر به کاهش سیگنال می گردد

شروع انجام تست الایزا بدون انتظار جهت به دمای اتاق رساندن معرف ها و پلیت های کیت الایزا از جمله عوامل شایع افت سیگنال و کاهش رنگ می باشد

حرارت پائین محیط کار بخش الایزا خراب بودن سیستم گرمایش آزمایشگاه منجر به افت سیگنال و رنگ دهی واکنش و بسته به واکنش غیر رقابتی یا رقابتی منجر به افت یا افزایش کاذب مقادیر تست ها می گردد (خصوصا در شرایط که تست ها بدون استاندارد همزمان خوانده شوند)

 High Background

• آلودگی چاهک به چاهک نمونه بیماران به دلیل مجاورت با کنترل مثبت یا استاندارد یا نمونه مثبت مجاور

• افزایش زمان انکوباسیون یا دمای انکوباسیون

انکوبه کردن بیش از حد یا در دمای بالا بر خلاف دستور العمل کیت منجر به افزایش سیگنال می گردد که به دلیل افزایش تعداد ترکیب های اتصالی نهائی می باشد

• شستشو کمتر از تعداد دفعات تعریف شده

این مسئله و یا استفاده از بافر با PH نامناسب یا دچار آلودگی باکتریال و قارچی منجر به عدم دفع واکنش های غیر اختصاصی و نهایتا افزایش سیگنال یا رنگ نهائی می گردد

• کاربرد فیلتر نامناسب در الایزا منجر به افزایش سیگنال می گردد

حرارت بالا محیط کار بخش الایزا خراب بودن سیستم سرمایش آزمایشگاه خصوصا در مناطق گرم و مرطوب شمال یا جنوب کشور منجر به تغییر سیگنال و رنگ دهی واکنش و بسته به واکنش غیر رقابتی یا رقابتی منجر به افت یا افزایش کاذب مقادیر تست ها می گردد (خصوصا در شرایطی که تست ها بدون استاندارد همزمان خوانده شوند)

• افزایش غلظت و تیتر کنژوگه

افزایش غلظت کنژوگه کیت الایزا به دلیل تبخیر یا تغلیظ ( باز ماندن درب ظرف کنژوکه به مدت طولانی در حرارت اطاق در چند نوبت مکرر) یا اشتباه کارخانه سازنده در تعیین تیتر مناسب تبخیر و تغلیظ نمونه های استاندارد کیت به دلیل باز ماندن طولانی درب ویال استاندارد ها در چند نوبت مکرر

• آلودگی پیپت و دیسپنسر مورد استفاده برای سوبسترا با معرف کنژوگه / عمدتا به دلیل اشتباه پرسنلی و استفاده مشترک از یک پیپت است

• آلودگی سوبسترا به یون های فلزی و اکسیدان ها یا مجاورت با نور که منجر به تشکیل رنگ زمینه ای آبی پر رنگ ( پس از اختلاط سوبسترا و کروموژن) قبل از مجاورت با پلیت می گردد (جهت سوبسترا و کروموژن تیمیدین متیلن بلو)

منابع خطا شایع در روش ELISA

حداکثر زمان مجاز جهت نگه داری خون کامل جدا نشده در 37 درجه 5 دقیقه می باشد ( زمان طولانی تر علاوه بر تخریب ساختار پروتئینی برخی هورمون ها و آ نالیت های حساس منجر به آزاد سازی برخی فاکتور های سرمی در محیط شده که منجر به افزایش کاذب جذب می گردد.

• نمونه حتی الامکان نبایست همولیز / لیپمیک یا ایکتریک باشد دلیل آن تداخل رنگ اضافی در واکنش رنگ سنجی الایزا ریدر است

• نمونه های هورمون یا سایر آنالیت ها حداکثر تا 48 ساعت بدون شرایط انجماد در یخچال 2-8 درجه قابل نگهداری است و در زمان های بالای 48 ساعت بهتر است در فریزر نگهداری شود.

ذوب و فریز مکرر نمونه منجر به کاهش سطح هورمون های سرم خصوصا هورمون های تیروئیدی می گردد لذا بهتر است اگر نمونه سرم در چند ردیف کاری نیاز به ذوب دارد در چند ویال فریز و در هر نوبت یک ویال دفریز گردد در ضمن نمونه سرم که از فریزر خارج می گردد به دلیل شیب غلظتی که در ته لوله حاصل شده است بایستی به خوبی قبل از استفاده میکس گردد و به حرارت اطاق رسانده شود.

• اجزا کیت پس از خروج از یخچال الزاما بایستی به حرارت اطاق و تعادل دمائی با محیط برسد. دمای پایین با کاهش سرعت واکنش انزیمی منجر به ایجاد جذب های غیر یکنواخت خصوصا در استریپ های ابتدائی پلیت می گردد

• رطوبت محیط کار ایمونواسی بایستی کمتر از 70 درصد باشد.

• اسیدی یا قلیائی شدن بافر (به دلیل الودگی قارچی یا باکتریال) منجر به افزایش یا کاهش کاذب جذب می گردد و PH اپتیمال پروسه فعالیت آنزیمی را از بین می برد لذا تهیه تازه به تازه بافر مورد نیاز در هر ردیف کاری قابل توصیه می باشد

• دمای محیط آزمایشگاه بایستی 20 تا 25 درجه باشد و با دماسنج دقیق روزانه کنترل و ثبت گردد . دمای بالا محیط افزایش کاذب جذب و بالعکس حاصل می نماید

• تغییرات دمائی مجاز انکوباتور 37 درجه 2± درجه باشد

 خطای ناشی از شوک حرارتی به پلیت در آنزیم ایمونو اسی Edge effect (اثر لبه ای)

اثر لبه ای ) می باشد که در قسمت مجاور درب انکوباتور 37 درجه و در مجاورت پنجره ها بر روی میز کار هورمون شناسی ممکن است بر روی پلیت رخ داده و منجر به ایجاد جذب های غیر یکنواخت در استریپ های شوک خورده و سایر استریپ می گردد(شوک سرمائی یا گرمائی) لذا قابل توصیه می باشد پلیت ها درعمق انکوباتور قرار داده شود و میز کار هورمون در مجاور پنجره یا سیستم های سرمایش و گرمایش نباشد

• ایجاد حباب هوا در چاهک های پلیت مانع تماس کامل کنژوکه و سرم یا بروز جذب های غیر یکنواخت می گردد

• استفاده از پارافیلم یا کاور چسبنده مناسب در سطح پلیت در هر مرحله از انکوباسیون الزامی بوده و مانع تبخیر و حضور گرد و غبار در محیط حساس واکنش انزیمی می گردد . تبخیر معرف ها منجر به بروز افزایش کاذب جذب نوری می گردد

• قرار دادن پلیت در تاریکی پس از اضافه نمودن سوبسترا و کروموژن الزامی است و مانع بروز واکنش جذب اضافی و کاذب می گردد

• کنترل معرف های کیت الایزا قبل از مصرف الزامی است که شامل :

• کنترل سلامت معرف سوبسترا و کروموژن با اختلاط حجم مساوی از کنژوکه و مخلوط سوبسترا و کروموژن در یک لوله نو جداگانه است که بایستی با تغییر رنگ سریع به رنگ آبی همراه باشد

• کنترل ماکروسکوپی معرف های کیت به لحاظ کودرت ناشی از الودگی قارچی یا باکتریال و یا حضور جسم خارجی در معرف ها الزامی است. ظهور رنگ ابی در محلول کروموژن بی رنگ قبل از واکنش نهائی نشانه الودگی کروموژن به مواد اکسیدان و غیر قابل مصرف بودن آن می باشد

• تهیه محلول سوبسترا بیش از حد مورد نیاز و ماندن ان در محیط ازمایشگاه منجر به الودگی قارچی باکتریال معرف و بی اثر شدن معرف می گردد لذا محلول آماده به کار سوبسترا کروموژن بایستی حداکثر یک ساعت قبل از مصرف تهیه گردد و در تاریکی نگه داری گردد .

• ممانعت از تماس مستقیم دست با محلول کروموژن که حاوی حلال متانول و دی متیل سولفوکساید می باشد که سمیت داشته و دارای جذب پوستی می باشد

• میکس کردن آرام و زماندار کالیبراتور ها و نمونه ها قبل از شروع کار الزامی است

• با توجه به تغییر شرایط محیطی و پرسنلی در هر ردیف کاری استفاده از کالیبراتور ها در هر ردیف کاری الزامی است و استفاده از منحنی ذخیره شده در دستگاه صرفا جهت موارد ضروری و در صورت عدم دسترسی به کالیبراتورهای کیت قابل توجیه می باشد . استفاده از منحنی ذخیره کالیبراسیون از مهمترین منابع خطا های سیستماتیک در روش های ایمونو اسی می باشد .

• جابجائی لیبل ها در کالیبراتور در هنگام مونتاژ کیت ها امکان پذیر بوده و از علل مشاهده منحنی های غیر معتبر می باشد .

• در بوروشور کیت ها توصیه می گردد در اولین ردیف کاری استاندارد ها ( کالیبراتور ها) دوپلیکیت ( مضاعف) گذاشته شود تا ضریب دقت و صحت منحنی حاصل بالا برود

• در صورت عدم همخوانی کانال های سمپلر مولتی کانال(8 کاناله) یا رسوب نمک در یکی از شاخه های سمپلرمولتی کانال یا واشر احتمال بروز جذب های غیر یکنواخت در نمونه ها و استاندارد های مضاعف وجود دارد

• زمان خیس خوردن soaking Time زمان خیس خوردن در فواصل شستشو بایست حداقل 20 و حداکثر 40 ثانیه باشد تا منجر به دفع اتصالات غیر اختصاصی از مجاور اتصالات اختصاصی گردد.

• عدم تکان دادن پلیت( حداقل 20 ثانیه) پس از اضافه نمودن محلول اسیدی توقف دهنده واکنش منجر به عدم اختلاط کامل اسید با معرف ها و عدم توقف کامل واکنش آنزیمی و در نهایت پیشرفت واکنش انزیمی در پایان کار و تغییرجذب نمونه ها و استاندارد ها و شیب منحنی کالیبراسیون در زمان های مختلف می گردد

• توجه به اینکه مسیر خوانش و عبور نور در میکرو پلیت الایزا از بالا به پایین است پاک نکردن کف پلیت قبل از خوانش نهائی با الایزا ریدر منجر به ظهور جذب های غیر یکنواخت می گردد خصوصا آلودگی کف پلیت به چربی سطحی پوست دست یا بافر سرریز شده و خشک شده یا الودگی سطح میز کار

• فاکتور روماتوئیدی مثبت در بیمار منجر به بروز نتیجه مثبت کاذب در تست های الایزا می گردد لذا گرفتن شرح حال و انجام یک تست روماتوئید فاکتور در افراد مشکوک کمک کننده می باشد .

• آلودگی چاهک به چاهک Well to well contamination ناشی از سرعت بالای

تخلیه یا تخلیه عمودی محلول به داخل میکرو پلیت می باشد یا به دلیل پرکردن بیش از حد بافر داخل چاهک ها می باشد . تکنیک صحیح تخلیه به طور مایل و چسبیده به جدار جانبی و فوقانی چاهک می باشد . جهت جلوگیری الودگی چاهک به چاهک در تست های کیفی یا کمی توصیه می گردد کنترل منفی ابتدا ریخته شود و سپس کنترل مثبت ریخته شود در ضمن تست مجاور کنترل مثبت به طور مضاعف و در انتهای پلیت مجددا ریخته شود .

• اثر قلابی یا تله ای Hook effect

همان پدیده پروزون در واکنش های ایمونواسی می باشد که به دلیل غلظت بسیار بالا انتی ژن بروز کرده و منجر به بروز جواب های منفی کاذب ( بینابینی ) می گرد د خصوصا در تست های کمی فریتین AFP/ TSH/ PSA/CA 125 اثر قلابی یا تله ای به دلیل پرشدن کلیه انتی ژن بایندینگ سایت ها ی کنژوگه توسط انتی ژن های فراوان موجود در محیط می باشد که به عبارتی با نوترالیزه کردن انتی ژن مانع تماس انتی ژن با آنتی بادی کف پلیت می گردد.

 راه پیشگیری از اثر قلابی در کیت های الایزا :

• اضافه نمودن یک مرحله شستشو قبل از افزودن آنتی بادی نهائی ( ثانویه)

• استفاده اولیه از رقت مناسب برای نمونه های سرم با استفاده از رقیق کننده

• خود کیت و در صورت عدم دسترسی استفاده از سرم افراد نرمال .

 جذب زمینه ای بالای پلیت   High back ground noise

زمانی که جذب بافر فسفات در چاهک (به تنهائی) بیش از 0.1 باشد می توان با اضافه کردن یک تا دو نوبت شستشو اضافی این اثر زمینه ای را ازبین برد در صورتی که جذب کنترل منفی کیت بالا باشد میتوان سایت های غیر اختصاصی را حذف و جذب نموده تا جواب های مناسب بدست آوریم.

• تنظیم فیلتر دستگاه توسط فیلتر خاکستری ( گری فیلتر ) در سه طول موج پایین و متوسط و بالا توسط شرکت پشتیبان (شش ماهه یا سالانه ) منجر به افزایش اعتماد به صحت طول موج های اندازه گیری در الایزا ریدر می گردد.

• جهت کنترل تکرار پذیری فتومتر می توان از یک محلول رنگی یکنواخت و پایدار مثل دی کرومات پتاس در میکروپلیت استفاده نمود و دریافت جذب های یکنواخت نشانه سلامت سیستم نوری فتومتر است (در غیر این صورت جذب های غیر یکنواخت بدست می آید.

رانش در سنجش (DRIFT)

• رانش عبارت است از اختلاف غلظت حاصل از یک نمونه واحد در موقعیت های مختلف، یک پلیت در یک نوبت کاری، بهترین راه شناسائی رانش استفاده دوپلیکیت کنترل یا نمونه از قبل تعیین شده در ابتدا و انتهای پلیت در یک ردیف کاری می باشد. دلایل اصلی رانش در سنجش :

1- شایعترین علت دریفت یا رانش سنجش تعداد آزمایش بالا در یک ران یا ردیف کاری می باشد به نحوی که بین افزودن محلول ها فاصله زمانی طولانی وجود داشته باشد .

2- ناهمگونی بین چاهک ها

 3- عدم رعایت ترتیب در ریختن ریژنت ها از ابتدا تا انتها پلیت

4- سرد بودن معرف ها در هنگام شروع به کار منجر به اختلاف دما اولین چاهک با آخرین چاهک و رانش در سنجش می گردد

5- مخلوط نشدن معرف ها در زمان ریختن به چاهک ها

6- واکنش کند و سریع محلول متوقف کننده نهائی جهت توقف نهائی واکنش

جهت دانلود کل مطلب بصورت فایل PDF بر روی لینک زیر کلیک کنید :

ELIZA.Kushan