الکتروفورز

تکنیک ها و کاربردهای الکتروفورز

الکتروفورز یک روش جداسازی و آنالیز ماکرو مولکول­های زیستی (RNA, DNA, Protein) و قطعات آنها بر اساس اندازه و بار می­باشد. این تکنیک در آزمایشگاه های تشخیصی جهت جداسازی پروتئین­ها با استفاده از بار و یا اندازه شان مورد استفاده قرار می­گیرد و در بیوشیمی و دیگر گرایش­های علوم سلولی و مولکولی به منظور جداسازی قطعات دارای اندازه­های مختلف DNA و RNA و همچنین مولکول­های پروتئینی بر اساس سایز می­باشد. مولکول­های اسید نوکلئیکی با اعمال یک میدان الکتریکی در ژل آگارز و گاها ژل اکریل آمید حرکت می­کنند و بر اساس اندازه جدا می­شوند. مولکول­های کوچک­تر سریعتر از مولکول­های بزرگتر حرکت می­کنند؛ این امر به دلیل مهاجرت راحت­تر آنها در منافذ ژل می­باشد. اما پروتئین­ها بر اساس بار­شان در آگارز جدا می­شوند زیرا منافذ ژل بسیار بزرگ­تر از آن هستند که بتوانند پروتئین­ها را غربال نمایند. همچنین تکنیک ژل الکتروفورز می­تواند به منظور جداسازی نانوذرات مورد استفاده قرار بگیرد.

از جمله کاربردهایی که ژل ها در هنگام الکتروفورز بر عهده دارند، مهار نمودن کنوکسیون دمایی ایجاد شده در اثر میدان الکتریکی، غربال­گری و نیز ایجاد تاخیر در حرکت مولکول­ها می­باشد. ژل الکتروفورز DNA معمولا به منظور تجزیه و تحلیل بعد از تکثیر DNA با استفاده از تکنیک PCR به کار می­رود، اما ممکن است به عنوان یک تکنیک جهت آماده سازی برای تکنیک­های دیگر مانند اسپکترومتری جرمی ، RFLP ، PCR ، کلون­سازی ، تعیین توالی DNA مورد استفاده قرار بگیرد.

در میدان الکتریکی ایجاد شده توسط منبع تغذیه (Power-Supply ) مواد دارای بار خالص مثبت به سمت قطب منفی و مواد دارای بار خالط منفی به سمت قطب مثبت حرکت می­نمایند (شکل 1). در ژل الکتروفورز آگارز پس از اعمال ولتاژ و جریان مورد نظر، مولکول­های با اندازه بزرگ­تر دارای حرکت کندتری در خلل و فرج ژل آگارز می­باشند. همین اندازه مختلف مولکول­ها موجب ایجاد باندهای مجزا و متفاوتی خواهد شد. معمولا ژل­های انتخاب شده جهت عمل الکتروفورز، از جنس پلی­مر­های دارای قدرت ایجاد پیوند متقاطع (cross-linked polymer) می­باشند که نوع این پلیمر و نیز میزان نفوذ پذیری آن بر اساس نوع ترکیب و وزن خاصی که قرار است جدا گردد، انتخاب می­شود.

هنگامی که قرار است پروتئین­ها و یا اسید­های نوکلئیک کوچک از جنس DNA یا RNA جدا شوند، معمولا از غلظت­های متفاوتی ژل اکریل امید و کراس ­لینکر استفاده می­شود که ایجاد شبکه ­های پلی اکریل آمیدی با اندازه منافذ مختلف ایجاد می­گردند. اکریل آمید نوعی نورو توکسین می­باشد که باید بسیار با احتیاط استفاده شود. اما زمانی که اندازه اسید­های نوکلئیک از چندصد جفت باز بیشتر گردد ، بهتر است از ژل آگارز جهت جداسازی استفاده گردد. آگارز متشکل از زنجیرهای بودن شاخه و بلند و بدون بار کربوهیدرات می­باشد که کراس لینک نیز ندارند؛ همین امر موجب ایجاد ژل با اندازه منافذ بزرگ برای جداسازی ماکرومولکول­ها میگردد (شکل 2).

در هنگام عمل الکتروفورز بسته به اندازه و اختلاف وزنی که جمعیت مولکول­ها با هم دارند و نیز میزان ولتاژی که اعمال می­گردد، زمان الکتروفورز متفاوت خواهد بود. در صورتی که مدت زمان عمل الکتروفورز کم باشد روی هم افتادن باندها و نیز اسمیرهای غیر قابل تمایز قابل مشاهده خواهند بود. اما اگر مدت زمان این عمل زیاد باشد ممکن است مولکول­ها از ژل خارج گردند.

به منظور تشخیص وزن مولکول­های جداشده معمولا مارکرهای وزنی معینی وجود دارند که همگام با ران نمودن نمونه­ ها ران می­گردند. این مارکر که به Ladder نیز معروف می­باشند، حاوی مخلوطی از مولکول­های دارای وزن مشخص می­باشند. معمولا نکته­های که در مورد ladderها ضروری می­باشد، این است که متناسب با جمعیت مولکولی که قرار است جدا شود، ladder را انتخاب نمود. این ladder باید حاوی مارکرهای دارای وزن کمتر و نیز بیشتر از مولکولی هدفی که قرار است جدا گردد، باشند. فاصله­ای که یک باند طی می­نماید با لگاریتم اندازه مولکول متناسب میباشد (شکل 3). عمل الکتروفورز در بافر صورت می­گیرد تا از تغییرات pH جلوگیری بعمل آورد. در واقع pH فاکتوری بسیار اساسی و مهم در عمل الکتروفورز می­باشد. همان­گونه که پیش­تر گفته شد، الکتروفورز تکنیکی بر اساس بار خالص و وزن مولکول­ می­باشد.

انواع ژل و انواع الکتروفورز

الکتروفورز به دو شکل افقی و عمودی انجام می‌گیرد. هر کدام از این دو نوع مصارف خاص خود را دارند. یکی از تفاوت‌های بین این دو نوع الکتروفورز جهت قرارگیری ژل است، به طوری که در الکتروفورز افقی ژل به صورت افقی در محیط بافر قرار می‌گیرد، اما در الکتروفورز عمودی ژل به صورت عمودی و درون محفظه الکتروفورز قرار گرفته است و به طور کامل با بافر در تماس نیست. ژل مورد استفاده در الکتروفورز افقی ژل آگاروز است و در الکتروفورز عمودی از ژل پلی‌آکریلامید استفاده می‌شود. در تهیه آکریلامید، اکسیژن برای پلیمریزه شدن به عنوان یک مهارکننده عمل می‌کند، به همین دلیل از این ژل در الکتروفورز افقی (که ژل در معرض اکسیژن هوا قرار می‌گیرد) نمی‌توان استفاده کرد.

مهمترین انواع ژل مورد استفاده در عمل الکتروفورز ژل آگارز و اکریل آمید می­باشند. هر نوع ژل می­تواند به خوبی برای انواع اندازه­ها و گونه­های آنالیت مورد استفاده قرار بگیرد. ژل­های پلی اکریل آمید معمولا برای پروتئین­ها مورد استفاده قرار می­گیرند و نیز دارای قدرت تفکیک خیلی بالایی برای قطعات DNA با اندازه بین ۵-۵۰۰ جفت باز میباشند. از طرف دیگر ژل­های آگارز دارای قدرت تفکیک کمتری­ برای DNA می­باشند ولی دارای طیف وسیع­تری از جداسازی می­باشند و بنابراین برای قطعاتی DNA بین ۵۰ تا ۲۰۰۰۰ جفت باز مناسب می­باشند.

نحوه تهیه این ژل­ها نیز با هم متفاوت می­باشد. برای تهیه آگارز باید آن را به صورت محلول حرارت داد، اما برای تهیه پلی اکریل آمید باید آن را به طریق پلیمریزاسیون با استفاده از ماده شیمیایی تهیه نمود. ژل­های آگارز دارای منافذ با اندازه­های متفاوت می­باشند ولی برای جداسازی پروتئین­های با اندازه بیشتر از ۲۰۰ کیلو دالتون می­توانند مورد استفاده قرار بگیرند. فاصله بین باندهای DNA دارای طول متفاوت متاثر از میزان درصد آگارز می­باشد. اغلب ژل­های آگارز از درصد ژل بین ۰٫۷ درصد (برای جداسازی قطعات DNA  بین ۵ تا ۱۰ کیلو باز ) و ۲ درصد (برای جداسازی قطعات بین ۰٫۲ تا ۱ کیلو باز) می­باشند. ژل­های با درصد آگارز بالاتر از ۳ ٪ را می­توان برای جداسازی قطعات خیلی کوچک استفاده نمود؛ اما برای این قطعات بهتر است از ژل پلی اکریل آمید به صورت عمودی برای جداسازی آنها استفاده شود. برای بسیاری از جداسازی­ها ژل ۱ ٪ آگارز بهترین مورد می­باشد.

ژل­های پلی اکریل آمید (PAGE) به دلیل اندازه منافذ یکنواختی که درست کرده­اند ، برای جداسازی پروتئین­های با اندازه بین ۵ تا ۲۰۰۰ کیلودالتون مناسب می­باشند. اندازه منفذ با تغییر میزان پودر اکریل آمید و بیس اکریل آمید بکار رفته در تهیه ژل تغییر میکند. این نوع ژل به دلیل ماهیت مواد اولیه خود که خطر آفرین می­باشند کاربری کمتری نسبت به قبل دارد و بیشتر جهت جداسازی پروتئین­ها مورد استفاد قرار می­گیرد.

ژل اکریل آمید در دو نوع ژل تهیه می­شود: ژل Stacking و ژل Resolving 

ژل Stacking بر روی ژل Resolving ریخته می­شود و درصد آن ۵ ٪ می­باشد. ولی ژل Resolving بین ۶ تا ۱۵ درصد تهیه می­گردد. درصد انتخاب شده در این نوع ژل به اندازه پروتئین هدف بستگی دارد. هرچه که وزن آن کمتر باشد درصد اکریل آمید بکار برده بیشتر خواهد بود.

نشاسته

نشاسته بدست آمده از سیب زمینی که به صورت نیمه هیدرولیز گردیده است نیز می­تواند محیطی مناسب و غیر سمی جهت جداسازی پروتئین­ها ایجاد نماید. در این نوع ژل پروتئین­های غیردناتوره می­توانند بر اساس بار و وزن جدا شوند. ژل نشاسته معمولا بین ۵ تا ۱۰ درصد می­باشد.

شرایط ژل

دناتوره نمودن

دناتوره نمودن ژل­ها معمولا در شرایطی که ساختار طبیعی آنالیت به هم ریخته می­شود و به صورت خطی در می­آید، ایجاد می­شوند. هنگامی که ماکرو مولکول­ها دناتوره می­گردند، حرکت آنها بر روی ژل تنها به اندازه خطی و نیز نسبت جرم به بارشان بستگی خواهد داشت. بنابراین ساختارهای دوم، سوم و چهارم آنها از بین خواهد رفت که تنها ساختار اولیه جهت آنالیز باقی خواهد ماند. اسیدهای نوکلئیک اغلب با افزودن اوره در بافر دناتور می­گردند، اما پروتئین­ها با استفاده از سدیم دودسیل سولفات (SDS) دناتوره می­گردند که این در واقع قسمتی از ژل SDS-PAGE خواهد شد. به منظور دناتوراسیون کامل پروتئین­ها ، لازم است باندهای دی­سولفید آنها که ایجاد پیوند کوالان کرده­اند و ساختار سوم و چهارم آنها را پایدار نموده است توسط یک روش به نام Reducing PAGE از بین برود. معمولا با استفاده از بتا مرکاپتواتانول و یا دی­تیوتریتول این باندها شکسته می­شوند. Reducing PAGE معمول­ترین شیوه رایج الکتروفورز پروتئین می­باشد.

در اسیدهای نوکلئیک شرایط دناتوره برای تخمین دقیق وزن مولکولی RNA ضروری می­باشد. مولکولهای RNA قادراند برهمکنش­های درون مولکولی بیشتری نسبت به DNA ایجاد کنند که این امر بر روی تحرک الکتروفورزی آنها تاثیر بسزایی خواهد داشت. اوره، DMSO و گلای اکسال معمولترین عوامل دناتوره کننده برای تخریب ساختار RNA می­باشند.

ژل ­های native در شرایطی غیر-دناتوره کننده ران می­شوند ، بنا براین ساختار طبیعی آنالیت حفظ می­شود. این امر موجب تاثیر گذاری شکل مولکول در تحرک آن خواهد شد و بنابراین هر چهار سطح پروتئین قابل بررسی خواهند بود. از آنجایی که در این نوع ژل­ها ساختار طبیعی پروتئین­ها حفظ می­شود، نتنها می­توان آنها را استفاده از روش­های رنگ آمیزی معمول بررسی نمود، بلکه همچنین می­توان با استفاده از روش­های رنگ آمیزی ویژه enzyme-linked آنها را بررسی نمود. ژل الکتروفورز native معمولا برای تحقیقات پروتئومیکس و متالومیکس مورد استفاده قرار می­گیرد. اگرچه، native-PAGE نیز می­تواند برای اسکن ژل­های حاوی جهش­های ناشناخته مانند تکنیک SSCP مورد استفاده قرار بگیرند.

بافرها

نقش بافرها در الکتروفورز فراهم نمودن یون­های حامل جریان بین دو قطب و نیز حفظ نمودن pH محیط انجام الکتروفورز می­باشد. بافر تریس- استات- (EDTA (TAE و بافر تریس- بورات- (EDTA (TBE از جمله مهمترین بافرهای مورد استفاده برای اسیدهای نوکلئیک می­باشند. بافر TAE دارای ظرفیت بافری پایینی میباشد، اما کیفیت نتایج آن برای توالی ­های DNA با طول بلند بسیار خوب می­باشد. بافرهای دیگری نیز برای الکتروفورز آگارز استفاده می­شود که از عمومیت کمتری برخوردارند. اما اغلب جداسازی­های پروتئینی تکنیک SDS-PAGE با استفاده از سیستم DISC بافر صورت می­گیرند که بطور قابل ملاحظه­ای کیفیت باندهای بدست آماده را افزایش می­دهد.

مشاهده باندهای جدا شده در سیستم الکتروفورز

بعد از اتمام عمل الکتروفورز، باید جهت مشاهده مولکول­های موجود در ژل، آنها را رنگ­امیزی نمود. DNA را می­توان با استفاده از اتیدیوم برماید رنگ آمیزی نمود. این رنگ هنگامی که بین دو رشته DNA قرار می­گیرد، تحت نور فرابنفش ، فلوئورسانس ساطع می­کند. رنگ­های نقره و کماسی برلیانت بلو جهت مشاهده پروتئین­ها استفاده می­شوند. روش­های دیگری ممکن است جهت مشاهده جداسازی اجزای موجود در ژل استفاده شوند. معمولا به منظور عکس برداری از ژل­های رنگ­آمیزی شده از دستگاه ژل داک استفاده می­کنند.