بیولوژی مولکولی – پروتکل ها

روش استخراج RNA از سلول

شما در روزهای قبل سلول های مورد نظرتون رو در پلیت های ۶ خونه و یا فلاسک T25 کشت دادید. لازمه بدونید اینکه سلول ها رو در چه پلیتی کشت بدید کاملا بستگی به میزان نیازتون به  RNA داره و عموما برای بسیاری از سلول ها از جمله سلول های سرطانی بهتره از پلیت های ۶ خونه و یا فلاسک T25 استفاده کنین تا مقدار بیشتری RNA بتونین استخراج کنین. بعد از کشت باید بسته به طرح، سلول ها رو با دارو و یا ماده ای که قراره اثرش رو در تغییرات بيان ژن بررسی کنیم تیمار خواهیم کرد. دقت کنید اینکه از چه دوزی و یا چه مدت زمان اثر دارو برای سلول هاتون استفاده کنین رو باید از روش هایی چون MTT بدست بیارید. حالا ما سلول هایی داریم که با ماده ی مورد نظرمون تیمار شدن و دقیقا شرایطی دارن که ما میخوایم در اون تغییرات بيان ژن هامون رو بسنجیم. از اینجا کار استخراج RNA شروع میشه و همانطور که میدانیم در اکثر آزمایشگاه های ایران با استفاده از  RNA XPLUS و Trizol بعنوان روش های مرسوم استخراج RNA انجام میگیرد. اساس این روش بر مبنای ماده گوانیدین تیوسانات و فنل – کلروفرم می باشد. به طور کلی استخراج RNA با استفاده از روش فنل-کلروفرم از ٦ مرحله ی کلی تشکیل شده  . . .جهت دریاف فایل کامل با تمامی جزئیات با شرکت کوشان زیست تماس بگیرید . . .

 

استخراج RNA از بافت

استخراج RNA از بافت  نیز با کمک RNAXPLUS و یا trizol طبق پروتکل بالا است اما در کار با بافت مرحله ی هموژنیزه کردن بافت خیلی مهم است و عموما بعد از وزن کردن و جداکردن مقدار مشخص از بافت مورد نظر،  ابتدا به ازای ۱۰۰ میلیگرم بافت ۱سی سی تیازول یا RNA XPLUS اضافه میکنیم و بعدش زیر هود با سرسمپلر در پلیت های پتریدیش کاملا میکوبیم و ورتکس میکنیم تا محلول شفاف بدست بیاید. هر چقدر این مرحله رو طول بدیم بهتره تا کاملا بافت هموژن بشه ( عموما یک تا یک و نیم ساعت باید طول بکشه) استخراج از بافت با استخراج RNA  از سلول تفاوت انچنانی نداره فقط مرحله ی هموژن کردنش کمی سخت تر و زمان برتر میباشد. اهمیت استخراج RNA به تجربه و دقت کار بر میگردد. چند نکته رو اینجا یادآور میشم که نقش مهمی در بالا بردن کیفیت RNA استخراج شده دارد. بدلیل حساس بودن RNA به محیط اطراف بهتره که مراحل استخراجRNA زیر هود انجام بشه. از سوی دیگر در تمام مراحل کار حتما یک ظرف یخ در کنار خود داشته باشین و ویال ها و مواد رو روی ان نگه دارید. . . .جهت دریاف فایل کامل با تمامی جزئیات با شرکت کوشان زیست تماس بگیرید . . .

بررسی کیفی و کمی RNA استخراج شده

حساسترین مرحله استخراج RNA مرحله ی ارزیابی کیفی میباشت چون اگر RNA کیفیت خوبی نداشته باشد پس cDNA خوبی هم از روی آن ساخته نمیشود و در نتیجه تمام کارهای مراحل قبلی رو باید از نو انجام بدهید. بررسی RNA استخراج شده عموما در دو جنبه انجام میشه…۱-بررسی کیفی ۲- بررسی کمی با بررسی کیفی ما کیفیت RNA مون رو ارزیابی میکنیم در این مرحله اگر RNA ما دگرده شده باشه و یا کیفیت خوبی نداشته باشه روی ژل مشخص میشه. در بررسی کمی ما غلظت RNA استخراجی رو بررسی میکنیم و بر طبق اون مقداری از RNA رو که باید برای سنتز cDNA  برداریم محاسبه میکنیم. یکی از راه های مشاهده ی کیفیت RNA استخراج شده ، Run کردن RNA روی ژل آگازور است. حواستون باشه درصد ژل اگاروز بسته به هدف شما و اینکه چه چیزی رو میخواین روش run کنین، متفاوت می باشد. اگر هدفتون RUN کردن قطعات بزرگ و سنگینی مثل پلاسمید است باید درصد ژلتون ۰٫۷% باشه که برای ساختنش باید ۰٫۱۸۴ گرم از پودر اگاروز رو در ۲۵ سی سی بافر TAE 1X حل کنید. اگر هدفتون run کردن قطعات DNA با طول متوسط است باید درصد ژلی که درست میکنین ۱% باشه که برای ساختنش باید ۲۳ گرم از پودر اگارز رو در ۲۳ سی سی بافر TAE 1X حل کنید. و در نهایت اگر هدفتون run کردن قطعات کوتاهی از DNA و یا RNA است باید درصد ژلتون ۱٫۵% باشه که برای ساختنش باید ۰٫۳۴ گرم از پودر اگارز رو در ۲۳ سی سی بافر TAE 1X حل کنید. . . .جهت دریاف فایل کامل با تمامی جزئیات با شرکت کوشان زیست تماس بگیرید . . .

 

سنتز cDNA از RNA های استخراج شده

بعد از اطمينان از سلامت هريك از نمونه هاي RNA روي ژل آگارز و سنجش غلظت آنها با دستگاه نانودراپ(Nano Drop)، مقدار یک مایکرو گرم از هريك از نمونه ها براي تهيه cDNA استفاده میشود. تبدیل RNA به DNA تکنیکی است، که جهت تهیه cDNA که برای انجام RT-PCR صورت می پذیرد. الگوی اولیه در  RT-PCR، مولکول RNA تک زنجیره ای است. اما مستقیما با RNA نمی توان PCR انجام داد. از آنجایی که DNA  پلیمراز قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نمی باشد، مرحله دیگری به PCR اضافه شده است. طی این مرحله، با استفاده از آنزیم ریورس ترانسکریپتاز با منشاء ویروسی، از الگوی RNA،  cDNA مکمل آن سنتز می شود و یک رشته پلی نوکلئوتیدی DNA  از روی RNA ساخته می شود و بوسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد. برای ساخت DNA، از آغازگر عمومی (پرایمر) استفاده می شود. روش کار: براي انجام واکنش Real-Time PCR نياز به DNA داريم براي همين DNA مکمل يا  cDNAاز RNA بايد ساخته شود. براي ساخت از  rRNA و tRNA  از هگزامرهاي تصادفي استفاده ميشود ولي براي ساخت آن از mRNA از اليگو oligo dT استفاده ميشود. . . . جهت دریاف فایل کامل با تمامی جزئیات با شرکت کوشان زیست تماس بگیرید . . .

استخراج پلاسمید از باکتری (Plasmid Preparation)

روش استخراج پلاسمید با نام Plasmid Preparation یک تکنیک رایج برای جداسازی و خالص سازی پلاسمید از درون باکتری است.

کلونینگ DNA

کلونینگ DNA نوعی تکنیک زیست شناسی مولکولی است که در آن نسخه های زیادی از یک قطعه DNA مانند یک ژن تولید می شود. هدف از کلونینگ DNA، فراهم کردن نسخه‌های متعدد از یک ژن منفرد است. کلونینگ ژن به روش‌های مختلفی صورت می‌گیرد اما اساس همه‌ی آنها به این صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج می‌شود و با کمک آنزیم‌هایی برش داده می‌شود و به داخل یک مولکول DNA حلقوی، که معمولاً یک پلاسمید است و نقش ناقل (وکتور) را دارد، وارد می‌شود. به این ترتیب یک مولکول DNA نوترکیب ساخته می‌شود. در مرحله‌ی بعد DNA نوترکیب را به سلول میزبان که اغلب نوعی باکتری می‌باشد منتقل می‌کنند. این مرحله را ترنسفورماسیون می‌نامند. DNA نوترکیب در سلول میزبان همانندسازی می‌کند و همراه سلول میزبان تکثیر می‌شود. سلول‌های حاصل از تقسیم سلول میزبان اولیه، نسخه‌هایی از DNA نوترکیب همانندسازی شده را به ارث می‌برند. سلول‌های باکتری به دنبال تقسیمات متعدد کلنی تشکیل می‌دهند و از آنجا که اعضای این کلونی حاوی یک یا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکیب حمل می‌شود می‌باشد، می‌توان گفت این ژن کلون شده است. . . . جهت دریاف فایل کامل با تمامی جزئیات با شرکت کوشان زیست تماس بگیرید . . .